乳佐劑分類
1.1 已上市乳佐劑
佐劑發(fā)展簡圖
1.1.1 MF59
MF59 是一種水包油乳佐劑，以角鯊烯（體積分?jǐn)?shù) 4.5%-5.0%）為油相，兩種非離子表面活性劑聚山梨酯 80（Tween80，質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) 0.47%）和三油酸山梨坦（Span85，質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) 0.47%）為乳化劑，分散于檸檬酸緩沖液中形成。角鯊烯（C30H50）是一種天然三萜烯烴，廣泛存在于動(dòng)植物中，MF59 所用角鯊烯提取自鯊魚肝油；在人體內(nèi)，它是類固醇激素生物合成的中間產(chǎn)物，也是膽固醇的直接前體。Tween80 和 Span85 均為天然脂肪酸衍生物（主要來源于植物），核心作用是穩(wěn)定乳液：Tween80 的親水親油平衡值（HLB）為 15，Span85 的 HLB 為 1.8，兩者組合可達(dá)到角鯊烯乳化所需的最佳 HLB，從而形成均一、穩(wěn)定的乳劑。
1.1.2 AS03
AS03為水包油乳佐劑，油相由DL-α- 生育酚（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)4.7%）和角鯊烯（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)4.3%）組成，以非離子表面活性劑 Tween80（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) 1.94%）為乳化劑，分散于PBS（磷酸緩沖鹽溶液）中。與 MF59相比，AS03的顯著特點(diǎn)是添加了DL-α- 生育酚。生育酚是維生素E的異構(gòu)體之一，在自然界分布廣泛，也存在于人體肌肉、脂肪、腎上腺等組織中，具有抗氧化活性和免疫刺激特性，可防止脂膜氧化、維持細(xì)胞膜質(zhì)量，并通過參與基因表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。需注意的是，AS03所用 DL-α-生育酚為人工合成，而非植物提取。由于角鯊烯含 6 個(gè)雙鍵，極易氧化，DL-α- 生育酚的加入可降低其氧化程度，延長AS03的穩(wěn)定性。
1.1.3 AF03
AF03是法國賽諾菲巴斯德公司開發(fā)的水包油乳佐劑，由角鯊烯（質(zhì)量分?jǐn)?shù) 32.5%）、Polyoxyethylene hexadecyl ether、Span80（質(zhì)量分?jǐn)?shù) 4.8%）、甘露醇（質(zhì)量分?jǐn)?shù) 6%）和 PBS 組成。其制備方法與 MF59、AS03 不同，采用相轉(zhuǎn)變溫度（PIT）乳化工藝：基于非離子表面活性劑Polyoxyethylene在水溶液中的相變特性，當(dāng)水和油比例適當(dāng)時(shí)，低溫下可形成穩(wěn)定的水包油乳劑；溫度升高至相轉(zhuǎn)變溫度臨界值時(shí)，轉(zhuǎn)為油包水乳劑；溫度降至PIT以下時(shí)，恢復(fù)為水包油乳劑。因此，保存溫度對(duì)維持AF03的穩(wěn)定性至關(guān)重要。
1.2 正在研發(fā)中的乳佐劑
1.2.1 穩(wěn)定乳液（stable emulsion, SE）
SE 最初由美國 Edgar Ribi 公司開發(fā)，是一種水包油乳劑，由角鯊烯（體積分?jǐn)?shù) 10%）、卵磷脂（質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1.9%）、泊洛沙姆 188（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.091%）、生育酚（質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.05%）、甘油（體積分?jǐn)?shù) 1.8%）分散于 25 mmol/L、pH 5.1 的磷酸銨緩沖液中形成。后經(jīng)美國傳染病研究所改進(jìn)，調(diào)整角鯊烯含量至 2% 并去除了生育酚。單磷酰脂質(zhì) A（MPL）是脂多糖（LPS）的無毒衍生物，吡喃葡萄糖脂質(zhì) A（GLA）是 LPS 脂質(zhì) A 的六酰化衍生物，二者結(jié)構(gòu)類似，常以 SE 為基質(zhì)，形成 MPL-SE 或 GLA-SE 水包油乳佐劑。
1.2.2 W805EC NE
W805EC NE 是由美國 NanoBIO 公司開發(fā)的水包油乳佐劑，由大豆油（體積分?jǐn)?shù) 13%-38%）、Tween80（3.55%）、乙醇（4.04%）、氯化十六烷基吡啶（0.64%）和水組成，平均粒徑約 400 nm。由于氯化十六烷基吡啶是一種陽離子表面活性劑，可延長抗原在黏膜表面的停留時(shí)間并促進(jìn)抗原穿透黏膜，因此W805EC NE相比其他水包油型乳佐劑更適用于黏膜給藥途徑。
1.2.3 Co vaccine™HT
Co vaccine™HT 由英國 BTG 公司開發(fā)，是一種水包油乳佐劑，由角鯊?fù)椋w積分?jǐn)?shù) 9.9%）、Tween80、蔗糖脂肪酸酯和 PBS 組成，平均粒徑 130 nm。實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)顯示，該佐劑在 4℃保存 4 年無顯著變化，穩(wěn)定性良好。
1.2.4 AS02
AS02 佐劑是 GSK 公司開發(fā)的含有免疫刺激劑 MPLA 和 QS21 的水包油乳化劑。AS02 佐劑與 Mtb 融合抗原 Mtb72F（為 M72 的前身）配伍的疫苗已經(jīng)在不同動(dòng)物模型中進(jìn)行了測試。REED等在食蟹猴模型中證實(shí)了 Mtb72F/AS02 疫苗對(duì)預(yù)防 Mtb 感染具有保護(hù)作用。Mtb72F/AS02 疫苗Ⅰ 期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，接種者體內(nèi)產(chǎn)生高水平的抗原特異性體液免疫應(yīng)答和強(qiáng)烈的 CD4+ T 細(xì)胞免疫應(yīng)答，且持續(xù)期在 1 年以上。目前 AS02 佐劑主要應(yīng)用于瘧疾疫苗，其研究結(jié)果顯示 AS02 佐劑安全性高，接種者無明顯不良反應(yīng)，表明 AS02 佐劑不僅適用于結(jié)核疫苗，也有應(yīng)用于其他疫苗的潛力。
1.2.5 Pickering乳狀液
作為疫苗佐劑使用的Pickering乳狀液是一種微凝膠（明礬）穩(wěn)定的水相角鯊烯乳狀液。它與傳統(tǒng)表面活性劑乳狀液的主要區(qū)別在于系統(tǒng)不含有表面活性劑，而是使用具有一定親水性和親脂性的納米顆粒作為乳狀液穩(wěn)定劑。通過調(diào)整顆粒屬性和油水相參數(shù)，通過超聲處理獲得了顆粒穩(wěn)定的乳狀液。Pickering乳狀液具有無表面活性劑、毒性低和穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)。它們?cè)谑称贰⒅扑幒突瘖y品行業(yè)中有廣泛的應(yīng)用。
一些研究表明，Pickering乳狀液作為SARS-CoV-2疫苗佐劑增強(qiáng)對(duì)SARS-CoV-2 vaccine病毒的體液免疫是很有前景的。明礬佐劑比樹突狀細(xì)胞(DC)更粘附于細(xì)胞膜，導(dǎo)致缺乏細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移和抗原處理，從而限制了Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。為了解決這個(gè)問題，明礬通過水相角鯊烯吸附，形成明礬穩(wěn)定的Pickering乳狀液(PAPE)。由于其主要成分明礬和角鯊烯，PAPE具有良好的生物安全概況。
此外，由于明礬在油/水界面的密集排列，PAPE不僅吸附大量的SARS-CoV-2抗原，而且Pickering乳狀液對(duì)DCs具有更高的親和力，從而觸發(fā)了所傳遞抗原的攝取和交叉呈遞。由于T細(xì)胞的激活取決于抗原的數(shù)量，APCs可以吸附和呈遞更多的抗原，激活更多的T細(xì)胞，特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)就越明顯。在沒有表面活性劑的情況下，Pickering乳狀液的微米級(jí)顆粒和粗糙的表面形態(tài)為抗原吸附和細(xì)胞相互作用提供了大的比表面積，允許更有效的抗原積累。此外，PAPE組誘導(dǎo)的抗原特異性抗體滴度比鋁佐劑組高6倍以上，IFN-γ分泌T細(xì)胞多3倍，表明有效激活了體液和細(xì)胞免疫。
與MF59佐劑類似，Pickering乳狀液的佐劑效應(yīng)是由于油包水乳狀液配方，且沒有任何單一成分誘導(dǎo)類似佐劑的效應(yīng)。由于明礬顆粒的存在，Pickering乳狀液在注射部位形成抗原池，大約在注射后三天內(nèi)，然后吸引DC細(xì)胞浸潤和抗原攝取。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)，通過血清中的免疫病理學(xué)評(píng)估Pickering乳狀液作為佐劑的安全性和疫苗相關(guān)組織損傷；在給藥后幾天內(nèi)注射部位未檢測到顯著副作用，也未檢測到細(xì)胞因子風(fēng)暴的產(chǎn)生。然而，這些評(píng)估只是初步測試，證明了PAPE的佐劑屬性和安全性。盡管與Pickering乳狀液中的明礬劑量相關(guān)的副作用目前有限，但鋁的臨床神經(jīng)毒性是否會(huì)影響PAPE的廣泛使用需要進(jìn)一步研究。
1.2.6 Syntex佐劑配方（SAF）
SAF是一種含角鯊?fù)闉橛拖嗟挠桶闋钜海蒘yntex在1980年代開發(fā)，旨在減少以礦物油為油相的CFA(W/O)乳狀液的毒性，同時(shí)仍誘導(dǎo)有效的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。在PBS（pH 7.4）中，添加胞壁酰二肽之前SAF的最終組成為5% w/v角鯊?fù)椋?.5% w/v普朗尼克L121，和0.2% w/v Tween 80。與抗原和/或胞壁酰二肽混合并稀釋原液兩倍后，獲得這些組分的最終注射濃度。SAF的平均粒徑為150-160 nm。SAF乳狀液（在添加細(xì)胞壁酰二肽之前）非常穩(wěn)定，即使在冷凍條件下，也可以在室溫下保存六年而不會(huì)被破壞。SAF乳狀液刺激Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，主要表現(xiàn)為IgG2a抗體水平增加和細(xì)胞因子IFN-γ分泌增加。SAF還激活替代補(bǔ)體途徑作為另一種可能的輔助作用機(jī)制。許多不同的抗原與SAF結(jié)合使用，并顯示出良好的免疫活性。SAF對(duì)人體的肌肉刺激性很小，但在臨床試驗(yàn)中顯示出高度的反應(yīng)性；因此，它不再作為免疫佐劑產(chǎn)品使用，這可能與添加胞壁酰二肽有關(guān)。
1.2.7 DETOX
DETOX的成分包括細(xì)菌細(xì)胞壁骨架(CWS)和角鯊?fù)?1%)中的單磷酸脂A(MPL)和Twain 80(0.2%)的制劑。DETOX，也稱為Melacine，具有良好的佐劑活性，并已獲批準(zhǔn)作為治療性黑色素瘤疫苗。然而，DETOX佐劑的副作用是明顯的；它們?cè)谧⑸洳课环磻?yīng)性高，并可導(dǎo)致局部肉芽腫的形成。
1.2.8 PROVAX
PROVAX是一種由IDEC Pharmaceuticals開發(fā)的角鯊?fù)槿闋钜海渑浞脚cSAF類似，但在注射時(shí)將Pluronic L121的濃度降低到1.25% w/v，并去除了酰二肽。PROVAX是一種三倍濃縮物，由15% w/v角鯊?fù)椤?.75% w/v Pluronic L121和0.6% w/v Tween 80組成，可以誘導(dǎo)抗體和細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
開發(fā)關(guān)鍵點(diǎn)分析
乳佐劑的開發(fā)需在免疫增強(qiáng)效能、安全性及實(shí)際應(yīng)用可行性之間實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)平衡，其核心在于通過成分優(yōu)化和工藝及質(zhì)量控制，構(gòu)建既能高效激活免疫應(yīng)答，又能最大限度降低不良反應(yīng)的乳液體系。以下從關(guān)鍵維度展開分析：
2.1 核心成分的科學(xué)篩選
成分是乳佐劑性能的基礎(chǔ)，需兼顧免疫活性、生物相容性及穩(wěn)定性：
油脂相的精準(zhǔn)選擇：需優(yōu)先采用生物可降解或天然存在的油脂（如角鯊烯、植物源甘油三酯），替代傳統(tǒng)弗氏佐劑中的礦物油（如石蠟油）。這類油脂不僅能減少體內(nèi)長期沉積引發(fā)的肉芽腫風(fēng)險(xiǎn)，還可通過調(diào)控碳鏈長度（如 C16-C18 飽和脂肪酸）和飽和度，優(yōu)化抗原緩釋速率與免疫細(xì)胞吞噬效率。例如，MF59 佐劑選用角鯊烯作為油相，其與人體皮脂成分相似，生物相容性已通過數(shù)十年臨床驗(yàn)證。
表面活性劑的配伍優(yōu)化：以非離子型表面活性劑（如聚山梨酯 80、司盤 85）為主，避免離子型表面活性劑（如硬脂酸鋁）可能引發(fā)的局部炎癥。需通過復(fù)配比例調(diào)整，穩(wěn)定油-水界面張力，同時(shí)確保與抗原分子的兼容性，避免表面活性劑破壞蛋白質(zhì)抗原的二級(jí)結(jié)構(gòu)（可通過圓二色譜法驗(yàn)證）。
免疫刺激物的協(xié)同整合：在水包油乳劑體系中精準(zhǔn)添加免疫增強(qiáng)分子（如 TLR4 激動(dòng)劑 MPL、CpG 寡核苷酸），通過 “depot 效應(yīng) + 模式識(shí)別受體激活" 的雙重機(jī)制提升免疫應(yīng)答。需注意控制添加濃度，例如 MF59 未添加額外免疫刺激物卻能通過油相本身激活免疫，而 AS03 則通過DL-α- 生育酚與角鯊烯的協(xié)同增強(qiáng) Th1 型免疫。
合適的緩沖體系：如MF59中的檸檬酸緩沖液穩(wěn)定體系的pH和角鯊烯含量。研究表明，在常溫儲(chǔ)存條件下，未添加檸檬酸緩沖液的乳液中，pH值和角鯊烯含量會(huì)隨時(shí)間顯著下降。而添加檸檬酸緩沖液后，可有效抑制角鯊烯的氧化反應(yīng)，同時(shí)穩(wěn)定乳液的pH值和角鯊烯含量，從而提高佐劑的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
2.2 MF59生產(chǎn)工藝及中間品控制要點(diǎn)
MF59佐劑的生產(chǎn)工藝
粗乳制備需首先制備兩相，即油相（角鯊烯和三油酸山梨坦）和水相（聚山梨酯80與檸檬酸緩沖液）。兩相混合后經(jīng)連續(xù)剪切和“倒罐"剪切技術(shù)制備粗乳，利用均質(zhì)機(jī)產(chǎn)生的湍流、空化和機(jī)械剪切將粗乳液的粒徑控制在5000 nm以下。粗乳穩(wěn)定性受剪切方式、流速、剪切線速度及溫度等因素影響，生產(chǎn)過程中應(yīng)研究優(yōu)化剪切條件，合理控制流速和溫度，確保粗乳穩(wěn)定。
微流化是MF59佐劑生產(chǎn)的核心步驟，通過進(jìn)一步減小粒徑和提高乳液均勻性制備穩(wěn)定的納米乳液。粗乳在高壓條件下經(jīng)微流化裝置的相互作用室（通常為Ｙ型腔或Ｚ型腔），利用液壓剪切、沖擊、磨損、強(qiáng)湍流和氣蝕作用，將粒徑顯著減小，通常使乳液中的油滴平均粒徑小于220 nm，從而形成均勻納米乳液。在微流化過程中，粗乳可以在設(shè)備中多次循環(huán)，直至達(dá)到所需的粒徑和分散性。微流化的主要控制參數(shù)包括壓力、循環(huán)次數(shù)及溫度，這些參數(shù)直接影響乳液的粒徑和均勻性。根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)，如果粗乳需保存，應(yīng)開展穩(wěn)定性研究以確定合適的保存條件及時(shí)間，并重點(diǎn)關(guān)注粒徑變化和細(xì)菌內(nèi)毒素的控制，以確保產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。
過濾是MF59佐劑生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟之一，用于去除殘留的大油滴并進(jìn)一步提高乳液的均勻性和穩(wěn)定性。乳液經(jīng)微流化處理后，通過雙層過濾器進(jìn)行過濾，以防止大油滴在后續(xù)儲(chǔ)存過程中成為聚集點(diǎn)，從而引發(fā)乳液降解。經(jīng)微流化和過濾處理后的 MF59佐劑，應(yīng)控制乳液的平均粒徑和尾端大顆粒（1.2-400 μm）的數(shù)量以滿足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和應(yīng)用要求。此外，應(yīng)關(guān)注MF59佐劑的無菌控制，合理設(shè)置無菌過濾工藝。
對(duì)于MF59佐劑的疫苗成品配制，需根據(jù)抗原的穩(wěn)定性選擇配制方式。部分疫苗抗原在與角鯊烯乳劑佐劑配制和儲(chǔ)存時(shí)表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，對(duì)此可結(jié)合研究情況，考慮將抗原和佐劑分別包裝在單獨(dú)的小瓶中。而對(duì)于已證明在角鯊烯佐劑存在下具有長期穩(wěn)定性的抗原，可直接制備為單瓶制劑。
2.3 MF59質(zhì)量特性研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
MF59佐劑的質(zhì)量特性研究應(yīng)結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)工藝和預(yù)期產(chǎn)品特性,系統(tǒng)開展研究，并在此基礎(chǔ)上建立科學(xué)合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
MF59佐劑的常規(guī)理化指標(biāo)包括外觀、鑒別、pH、滲透壓及黏度、無菌等，其外觀應(yīng)為均勻的白色液體，無可見異物，pH值應(yīng)為中性。鑒別可通過對(duì)角鯊烯的鑒別實(shí)現(xiàn)，其余指標(biāo)控制可參考《中華人民共和國藥典》研究制定。
MF59佐劑中主要成分角鯊烯、聚山梨酯80和三油酸山梨坦的含量是佐劑的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，是生產(chǎn)過程及質(zhì)量放行中的重要監(jiān)測指標(biāo)。根據(jù)《中華人民共和國藥典》《美國藥典》（USP）及相關(guān)研究文獻(xiàn)，角鯊烯含量可采用氣相色譜法測定，而聚山梨酯80和三油酸山梨坦的含量可通過高效液相色譜法檢測。
粒徑及粒徑分布是納米乳佐劑的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，對(duì)佐劑的免疫效力和穩(wěn)定性具有直接影響。以角鯊烯為主要成分的水包油佐劑中，粒徑對(duì)免疫效力的影響尤為顯著。研究表明，乳滴大小顯著影響免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。小粒徑乳滴更容易被細(xì)胞吸收，進(jìn)而引發(fā)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，相比粒徑較大的佐劑，可誘導(dǎo)更高的抗體效價(jià)。此外，粒徑較小的乳液更易進(jìn)入淋巴細(xì)胞，從而減輕局部炎癥并減少注射部位形成油庫的風(fēng)險(xiǎn)。粒徑的測定通常采用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）技術(shù)，可準(zhǔn)確檢測粒徑及分散系數(shù)（PDI）。MF59佐劑的粒徑應(yīng)嚴(yán)格控制，且PDI應(yīng)小于0.3。對(duì)于尾端大顆粒（粒徑1.2-400 μm）的檢測，可采用基于單粒子光學(xué)傳感技術(shù)的光阻法（LE/SPOS），MF59佐劑的尾端大顆粒數(shù)量應(yīng)嚴(yán)格控制在1×107顆粒·mL-1以下。在實(shí)際生產(chǎn)和研究過程中，粒徑及其分布不僅作為生產(chǎn)中間品監(jiān)測和質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，也是佐劑及疫苗成品放行和穩(wěn)定性考察的關(guān)鍵項(xiàng)目，需進(jìn)行嚴(yán)格控制，以確保佐劑和疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量、效力及長期穩(wěn)定性。
乳液的穩(wěn)定性表征研究可從乳劑/乳滴的完整性、融合效應(yīng)及破乳效應(yīng)等方面展開系統(tǒng)分析。可基于以下項(xiàng)目開展研究，包括大顆粒數(shù)、分層檢查、離心穩(wěn)定性常數(shù)（Ke）、Turbiscan穩(wěn)定性、乳滴合并速度、乳液表面張力及表面電荷等。佐劑與抗原的相互作用研究方面，可借助多種先進(jìn)技術(shù)進(jìn)行深入探索。例如：采用Turbiscan穩(wěn)定性分析評(píng)估體系的物理穩(wěn)定性，利用液相原位透射電子顯微鏡（LPTEM） 觀察乳液納米結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，通過SEC?HPLC、傅里葉紅外光譜法、熒光光譜法及等溫滴定量熱法等方法解析佐劑與抗原間的分子相互作用機(jī)制。
艾偉拓作為藥用輔料供應(yīng)商，始終聚焦制劑市場需求，致力于為中國制藥企業(yè)提供優(yōu)質(zhì)、安全的藥用輔料解決方案。為疫苗研發(fā)客戶提供以下核心產(chǎn)品：
QS-21， CAS號(hào)：141256-0404 ，CDE登記號(hào)F20250000075
QS-7，CAS號(hào)：208933-54-4
QS-17
QS-18
QS-ANM
MF59
CpG ODN1018(HP) ，CAS號(hào)：937402-51-2
CpG ODN7909(HP)
CpG ODN9008(HP)
